Η βενζυλπενικιλλίνη δρα με τη δέσμευση σε συγκεκριμένες πενικιλλίνο-δεσμευτικές πρωτεΐνες (PBPs) που βρίσκονται στο εσωτερικό του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος και αναστέλλει το τρίτο και τελευταίο στάδιο της σύνθεσης του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Στη συνέχεια επέρχεται η κυτταρική λύση με τη μεσολάβηση βακτηριακών ενζύμων του κυτταρικού τοιχώματος, όπως οι αυτολυσίνες. Η βενζυλπενικιλλίνη είναι σταθερή κατά την υδρόλυση από μια ποικιλία β-λακταμασών, συμπεριλαμβανομένων των πενικιλλινασών, και κεφαλοσπορινασών και μεγάλου φάσματος β-λακταμάσες.