Η νεοστιγμίνη αναστέλλει τη δράση της χολινεστεράσης ενώ παρατείνει και εντείνει τις μουσκαρινικές και νικοτινικές δράσεις της ακετυλοχολίνης. Οι αντιχολινεστερασικές δράσεις της νεοστιγμίνης είναι αναστρέψιμες. Χρησιμοποιείται κυρίως λόγω της δράσης που ασκεί στους σκελετικούς μυς και λιγότερο συχνά για την αύξηση της δραστηριότητας των λείων μυών.